Tuğba Gezgin, Mustafa Karakaya
Selçuk Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümü
Özet Moleküler biyolojik analiz yöntemlerinin gelişimi ve yaygınlaşması sayesinde et ve et ürünlerinin kalitesinin belirlenmesinde yeni bilimsel yöntemler ortaya konulmaya başlanmıştır. Bu yeni yöntemler canlı hayvanın yetiştirilmesinden, işlenmiş son ürün haline gelinceye kadar tüm işlem aşamalarında moleküler biyolojik analiz tekniklerinin kullanımı sayesinde ürün kalitesinin belirlenip iyileştirilmesini hedeflemektedir. Günümüzde, genlerin, transkripsiyon ara ürünlerinin, proteinlerin ve metabolitlerin moleküler biyolojik yöntemlerle analizi sayesinde, et ürünlerine uygulanan işlemler, kullanılan et türü ile bazı dokular tespit edilebilmektedir. Ayrıca et kalitesinden sorumlu genlerin belirlenmesi sayesinde hayvan ıslahı çalışmalarında önemli ilerlemeler olmaktadır. Bu çalışmada, moleküler biyolojik analiz yöntemleri ve bu yöntemlerle et ve et ürünlerinde yapılan araştırmalar irdelenmiştir. Anahtar kelimeler: Et ürünleri, kalite, PCR, protein, metabolit, tür tayini
MOLECULAR BIOLOGICAL METHODS USED FOR DETERMINATION OF QUALITY FOR MEAT AND MEAT PRODUCTS
Abstract New methods have been developed and proposed to determine the quality of meat and meat products due to widespread use and development of molecular biological analysis techniques. By using these techniques, the product quality can be determined in all processing steps, ranging from breeding of the livestocks to the final processed products. Thanks to molecular biological analysis of genes, transcription of intermediate products, proteins and metabolites, processes that have been applied to the meat products, can be determined. Additionally, the animal species and/or the tissue type used can also be determined. In addition, further developments have been achieved in animal breeding studies by use of the knowledge on the genes responsible for meat quality. In this review, the molecular biological analysis techniques and the related studies were evaluated. Key words: Meat products, quality, PCR, protein, metabolic, species identification 9
5 1. GİRİŞ İnsan gıdası olarak et, kısaca kesilen kasaplık hayvanların kas dokularına denir. Bu gruba büyükbaş ve küçükbaş hayvanların iskelet kasları ve iç organlarıyla kümes hayvanları ve su ürünleri girmektedir. Et kalitesi; etin toplam özeliklerini tanımlamak için kullanılan bir terimdir. Et kalitesini pek çok faktör (hayvanın yetiştirilmesi, beslenmesi, kesim tekniği, kesim sonrası işlenmesi vb.) etkilemektedir. Et kalitesi, canlı hayvanın biyolojik özellikleriyle ilişkili olduğundan, son yıllarda, genetik, fizyoloji, hücre biyolojisi, biyokimya gibi biyolojik bilimler; gevreklik, su tutma kapasitesi gibi etin kalitesini gösteren özelliklerin canlılar arasındaki farklılığının arkasındaki biyokimyasal mekanizmaları tanımlamak amacıyla kullanılmaya başlanmıştır (1, 2).Tüketicilerin et ve et ürünlerinin kalitesine bakış açısı günümüzde değişikliğe uğramıştır. Ülkemizde orta ve düşük gelir grubunda yer alan tüketici alışkanlıkları ile ilgili yapılan bir araştırmaya göre; tüketiciler her türlü et ürününü insan sağlığı açısından 1. derecede tehlikeli gördüklerini belirtmişlerdir (3). Geçmiş yıllarda et ve et ürünlerinin kalitesini belirlemede; rengi, gevrekliği, tazeliği gibi bazı fiziksel ve kimyasal özellikleri yeterli olurken, son yıllarda et ve et ürünlerinin bileşimi, hangi tür hayvandan üretildiği, üretimde karkasın hangi kısımlarının kullanıldığı, katkı maddeleri, tağşiş yapılıp yapılmadığı tüketiciler tarafından en fazla merak edilen hususlar arasındadır( 4). 2003 yılında İngiltere'de “gıda etiketleme” yasasıyla ilgili yapılan bir düzenlemeyle, genel anlamda “et” ifadesi; kas doku, bağ doku ve içerdiği yağ miktarıyla sınırlandırılmıştır. Karaciğer, böbrek, akciğer ve kalp gibi karkasın belirli parçalarının ileri işlenmiş ürün formülasyonlarında kullanılması durumunda ise, ürün etiketinde açıkça yazılması gerektiği belirtilmiştir. Oldukça geniş bir ürün yelpazesini kapsayan “sakatat kullanılmıştır” ifadesine izin verilmemesi bildirilmiştir (5). Bu düzenlemeye göre de üretimde kullanılmış olabilecek sakatatların ürün içerisinde tespit edilmesi gerekliliği doğmuştur. Türk Gıda Kodeksi Et ve Et Ürünleri Tebliği'ne göre, et ürünleri karkas etinden veya sakatattan hazırlanmalı, karkas etinden hazırlanan et ürünlerine sakatat, sakatattan hazırlanan et ürünlerine ise karkas eti katılmamalıdır. Aynı zamanda et ürünleri sadece etiketlerinde belirtilen kasaplık hayvan etlerinden i m a l edilmelidir (6). Moleküler biyolojik analiz yöntemlerinin gelişimi ve yaygınlaşması sayesinde et ve et ürünlerinin kalitesinin belirlenmesinde yeni bilimsel yöntemler ortaya konulmaya başlanmıştır. Bu yeni yöntemler canlı hayvanın yetiştirilmesinden işlenmiş son ürün haline gelinceye kadar tüm işlem aşamalarında moleküler biyolojik analiz tekniklerinin kullanımı sayesinde ürün kalitesinin belirlenip ihtiyaç dahilinde iyileştirilmelerin yapılmasını hedeflemektedir. Moleküler biyolojik analiz tekniklerinde meydana gelen ilerlemeler, sığır, koyun, tavuk, manda, domuz gibi çeşitli hayvan türlerinden kaliteli ve verimli et eldesini sağlayan genlerin belirlenmesiyle ilgili çalışmaları da artırmıştır. Etin tüketiciler tarafından beğenilen özelliklerinden sorumlu olan genlerin belirlenmesinin, hayvan ıslah çalışmalarında verimliliğin ve kalitenin artırılmasına katkı sağlayacağı düşünülmektedir. Islah çalışmalarındaki amaçlardan biri de kasaplık hayvanların etlerinde arzu edilen özelliklerle ilgili gen/genlerin transferi veya arzu edilmeyen bir özellikten sorumlu gen/genlerin baskılanması yoluyla standart kalitede et üretiminin gerçekleştirilmesidir (2, 7). Kalite ile ilgili karakterlerin kantitatif özellik göstermesi dolayısıyla, klasik ıslah programlarında ortaya çıkan tıkanıklıkların moleküler genetik yöntemlerin kullanımı ile markör destekli seleksiyonlarla aşılmasına çalışılmaktadır. Günümüzde bu kapsamda çok sayıda moleküler ıslah programı yürütülmektedir.
2. MOLEKÜLER BİYOLOJİK YÖNTEMLER Moleküler biyolojik yöntemler DNA'ya dayalı analiz yöntemleri, transkripsiyona dayalı analiz yöntemleri, proteinlere dayalı analiz yöntemleri ve metabolitlere dayalı analiz yöntemleri olmak üzere dört grupta incelenebilir (8).
2.1. DNA'ya Dayalı Analiz Yöntemleri Et ve et ürünlerinde yapılan araştırmalarda 2 farklı DNA kaynağı kullanılmıştır; çekirdek DNA'sı ve mitokondrial DNA (mtDNA). Mitokondri, hayvanlarda çekirdek dışında DNA'ya sahip tek organeldir. DNA'ya dayalı analiz yöntemleri hibridizasyon tabanlı yöntemler ve PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) yöntemleri olarak 2 grup altında toplanmıştır (9)
2.1.1. Hibridizasyon tabanlı yöntemler (DNA hibridizasyon tekniği) Nükleik asit prob teknolojisi, PCR ve transkripsiyon yöntemlerinden çok önce yavaş üreyen veya üretilemeyen patojen mikroorganizmaların tespit edilmesi amacıyla kullanılmaya başlanmıştır. Prob, tek zincirli DNA veya RNA dizisi olup ilgi duyulan DNA veya RNA dizisinin komplementeridir. Uygun ısı, tuz, pH şartlarında prob, hedef DNA'ya bağlanır ve radyoaktif sinyallerin veya kemilüminesan ışımaların röntgen filmine alınması ile teşhis edilir (9,10). Günümüzde ise bu teknolojiden esinlenilerek problar Real-Time PCR ve Array Teknolojileri gibi ileri teknoloji uygulamalarına adapte edilmiştir.
2.1.2. PCR tabanlı yöntemler 1980'li yıllarda Kary Mullis tarafından geliştirilen PCR; DNA polimeraz enziminin kullanılmasıyla in vitro şartlarda DNA çoğaltılmasını ifade etmektedir. PCR, hedeflenen DNA bölgesinin milyonlarca kopyasını bir iki saat gibi kısa sürelerde oluşturabilen bir tekniktir. PCR' da DNA polimeraz enzimi yardımıyla genomun tamamı değil, spesifik bölgelerin kopyalanması gerçekleştirilir. Hangi bölgenin çoğaltılacağı ise çalışmanın amacına ve kullanılan yönteme bağlıdır. PCR yönteminin uygulanabilmesi için teorik olarak tek kopya DNA bile yeterli görülmektedir (11). Teorikte, PCR' a dayalı analizlerin ölçüm limitleri proteinlere dayalı olarak gerçekleştirilen bazı analiz yöntemleri (LC, ELISA, Elektroforez)'ne göre, daha düşüktür (4).
2.1.2.1. PCR tipleri Bugüne kadar yapılan araştırmalarda yaygın olarak kullanılan PCR tipleri: multipleks PCR, consensus PCR, nested PCR, in situ PCR, hot-start PCR, Realtime-PCR ve touchdown PCR' dır. Et ve et ürünlerinde yapılan araştırmalarda yaygın olarak kullanılan PCR tipleri ise multipleks PCR ve Realtime- PCR'dır. PCR çeşitleri, farklı şekillerde sınıflandırılabilir. Kalitatif veya kantitatif özelliğine göre ise ikiye ayrılır. Klasik PCR çeşitleri ve Realtime- PCR.
2.1.2.1.1. Realtime-PCR Gerçek zamanlı analize dayalı bu yöntemlerde prob tekniği; amplifikasyon esnasında oluşan floresan ışıma kullanılmaktadır veya nükleik asit amplifikasyonu ile eş zamanlı olarak artış gösteren floresans sinyalinin ölçülmesiyle kantitatif sonuç verebilen PCR yöntemleridir. Ticari olarak geliştirilmiş ve yaygın olarak kullanılan 3 cihaz; Stratagene (Agilent), Applied biosystems, Light Cycler(Roche)' dir. Son yıllarda et tür tayini ile ilgili yapılan araştırmalarda, Realtime-PCR tekniği yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (12, 13). Realtime-PCR ile kantitasyon çalışmalarında ortaya çıkan sorunlar, genelde analiz edilen numunenin bileşiminin bilinmemesi ile üretim sürecinde uygulanmış proseslerin DNA saflaştırma işlemini etkilemesinden kaynaklanan sorunlardır. Kantitatif analizlerde PCR etkinliği çok önemlidir. Bileşimi bilinen numune ile aynı konsantrasyondaki standart arasında sinyal açısından önemli derecede farklılık bulunuyorsa mutlaka önlem alınmalıdır. Böyle bir durumda DNA saflaştırma işleminin yeniden geliştirilmesi sorunu çözebilir (4). Ekstrakte edilebilir DNA miktarını, hayvanın türü, örneğin bileşimi, hücre yoğunluğu, saflaştırma işlemleri etkilemektedir. Farklı piliç parçalarından ekstrakte edilen DNA, organların, kas dokusuna göre daha fazla ekstrakte edilebilir DNA içerdiğini göstermiştir. Ciğer ve göğüs kasından ekstrakte edilen DNA' lar arasındaki fark 25 kat olarak bulunmuştur (14). Ekstrakte edilebilir DNA' lar arasındaki farklılıklar, sadece organ ve dokular arasında değil, türler arasında da değişmektedir (4), aynı DNA saflaştırma işlemi uygulanmış az ısıl işlem görmüş ve çok ısıl işlem görmüş bileşimi aynı olan iki örneğin sonuçları arasında 10 kat farklılık görüldüğü bildirilmiştir. Buna göre, örneklere uygulanan prosesler, DNA saflaştırma işlemini etkilemektedir. Bununla birlikte, et ve et ürünlerinde yapılan araştırmalarda, mitokondrial DNA ile daha hassas sonuçların elde edildiği belirtilmektedir (15, 16). Ancak analiz edilen et örneklerinin hangi dokulardan üretildiği bilinmiyorsa mitokondrial DNA'nın kullanımı kantitatif tayin için uygun değildir (4).
2.1.3 DNA'ya dayalı analiz yöntemleri ile yapılan araştırmalar Girish ve ark., (15) 12S rRNA mitokondrial geni üzerinde PCR-RFLP tekniğini kullanarak, farklı et türlerinin tanımlanmasını araştırmışlardır. Sığır, bufalo, koyun ve keçi etlerinin kalitatif olarak tanımlanmasında taze ve işlenmiş et örneklerinde tutarlı sonuçlar elde ettiklerini ancak et karışımlarında aynı başarıyı yakalayamadıklarını bildirmişlerdir. Yetim ve ark., (17) at, eşek ve domuz türlerine ait etleri ayırt etmek için mitokondrial DNA üzerinde spesifik primerler dizayn etmiş, bu oligonükleotidlerin kullanıldığı PCR reaksiyonları sonucunda; 120 ºC ve üzerinde ısıl işlem uygulanan ikili et karışımlarının hepsinde % 0,5 ve üzerindeki seviyelerde et türünü tespit edebilmişlerdir. Ong ve ark., (18) PCR-RFLP tekniğinde mitokondrial sitokrom b bölgesini kullanarak farklı et türlerinin tespitini araştırmışlardır. Araştırmalarının sonucunda farklı oranlarda karıştırdıkları domuz, sığır ve piliç eti örneklerinde 0,25 mg örnekte hızlı ve doğru bir şekilde farklı türleri tespit edebildiklerini bildirmişlerdir. Murugaiah ve ark., (19) mitokondrial gen (sitokrom b) üzerinde PCR-RFLP tekniğinden faydalanarak 6 farklı tür etinde (sığır, bufalo, bıldırcın, keçi, tavşan, tavuk), tür tanımlaması yagidaMAYIS pabilen bir yöntem geliştirmişlerdir. Doğruladıkları yöntem ile et karışımlarında domuz etini % 1 seviyesinde tespit edebildiklerini bildirmişlerdir. Kesmen ve ark., (16) çiğ ve pişmiş et ürünlerinde tür tanımlaması ve miktarının belirlenmesi amacıyla kullandıkları Real Time-PCR metodunu tanımlamışlardır. Araştırmalarında, sırasıyla eşek, domuz ve at eti için ND2, ND5 ve ATP 6- 8 mitokondrial genleri üzerine dizayn edilmiş spesifik primer ve TaqMan probu kullanmışlardır. Araştırmalarının sonucunda, TaqMan prob testinin çiğ ve pişmiş et ürünlerinde, et tür tanımlamasında hassas, hızlı ve güvenilir bir yöntem olduğunu belirtmişlerdir. Soares ve ark. (20), domuz ve kanatlı et türünü birbirinden ayırt etmek için sırasıyla sitokrom b ve 12S rRNA mitokondrial genlerini kullanarak, türe özgü kantitatif bir dublex-PCR metodu geliştirmişlerdir. Geliştirmiş oldukları yöntem ile düşük maliyetle, hızlı ve kolay olarak, kanatlı etine karıştırılan domuz etini % 0,1 hassasiyetle % 1-75 arasında tespit ettiklerini bildirmişlerdir. Kesmen, Yetim ve Şahin (21), sucuklarda, at, eşek ve domuz türlerine ait etlerin tespiti amacıyla spesifik bir PCR metodu geliştirmişlerdir. Bu çalışma kapsamında numunede her bir tür için % 0,1'den % 0,5'e kadar tüm seviyelerde farklı et türlerinin tespitini sağlamışlardır. Çalışmalarının sonucunda, geliştirilen spesifik PCR metodunun, et ürünlerinde bulunabilecek at, eşek ve domuz etlerinin tespitinde, ülkemiz gıda kontrol laboratuvarlarının ihtiyacını giderecek, rutin bir gıda kontrol metodu olabileceğini belirtmişlerdir.
2.2 Transkripsiyona Dayalı Analiz Yöntemleri Bir DNA kalıbından, RNA moleküllerinin sentezlenmesi işlemine “transkripsiyon” adı verilir. Bu işlem sonucunda, DNA'nın zincirlerinden birinin nükleotid dizisine eşlenik olan bir mRNA molekülü ortaya çıkmaktadır. Transkripsiyona dayalı yöntemler, mRNA' nın ölçülmesine dayanan yöntemlerdir (22). Bu yaklaşıma göre, herhangi bir proteinin sentezi esnasında ortamda mutlaka o proteinin sentezinden sorumlu mRNA molekülü olacaktır. Bundan dolayı aradığımız proteinin mRNA dizilimini biliyorsak, mRNA analiziyle ortamda o proteinin varlığı tespit edilebilir. Bu bilgi sayesinde mikroçipler veya problar oluşturulur. Oluşturulan mikroçip ve problar, farklı dokuların, farklı biyolojik durumların (gebelik, laktasyon, bağışıklık vb.), farklı tür etlerin veya dokuların tespiti için a r a ş t ı r m a l a r d a kullanılmaktadır.
2.2.1 Transkripsiyona dayalı analiz yöntemleri ile yapılan araştırmalar Oda ve ark. (23), PSE (Palea-Soft- Exudative)'li ve PSE'li olmayan piliçlerin Pectoralis major kasından izole ettikleri RNA'lar üzerinde RT-PCR metoduyla _-ryr ve _-ryr genlerinin gen ekspresyonu analizini yaparak farklılıklarını araştırmışlardır. Araştırmalarının sonucunda _- ryr geninin PSE probleminin oluşumunda etkili olabileceğini belirtmişlerdir. Li ve ark. (24), selenyumla zenginleştirilmiş maya ile beslenen domuzlarda Sepw1 geni ile etin su tutma kapasitesi arasındaki ilişkiyi araştırmışlardır. Çalışma sonucunda, rasyonlarında artırılmış Se ile beslenen domuzlarda, etin su tutma kapasitesi ile Sepw1 geni arasında negatif korelasyon olduğunu belirtmişlerdir. Zhang ve ark. (25), sığırların kaslar arası yağ gelişiminde etkili olan proteinleri tanımlamışlardır. Araştırmalarının sonucunda adipojenik farklılaşma sonrasında HSPB1 ve ATP5H proteinlerinin mRNA ekspresyonunun değişmediğini ancak CA2 ve MYL3 proteinlerinin azaldığını, miyojenik farklılaşma sonrasında ise, HSPB1 proteinin mRNA ekspresyonunun önemli derecede arttığını belirtmişlerdir.
2.3 Proteinlere Dayalı Analiz Yöntemleri Memeli dokuları 10000-30000 farklı protein türü içermektedir. Bu sebeple, bu protein türlerini birbirinden ayırt etmek, sınırlamak ve miktarını tayin edebilmek için çok farklı analiz teknikleri geliştirilmiştir. Farklı analiz tekniklerinin birbirilerine göre üstünlükleri ve zayıf yanları bulunmakla birlikte, hiçbir analiz tekniğinin tüm protein çeşitlerini tam olarak analiz edebilmekte olduğu söylenememektedir (2). Proteinlerin tanımlanmasında hücreden özütlenen proteinleri ayırmak ve tanımlamak için çeşitli teknikler kullanılmaktadır. Et ve et ürünlerinde proteinlerin tanımlanmasında ve analizinde yaygın kullanılan yöntemler, elektroforetik teknikler, MS (Mass Spectrometry: Kütle Spektrometresi), mikroçipler ve biyoenformatik'tir.
2.3.1 Elektroforetik yöntemler Elektroforez; bir çözeltide asılı taneciklerin elektrik alanı etkisiyle ayrılmasıdır. Elektriksel alandaki moleküller, yüklerine, boyutlarına ve şekillerine bağlı olarak farklı hızlarda hareket ederler (26). Elektroforez, moleküllerin ayrılmasında basit ve hızlı bir yöntemdir. Jel elektroforez, değişken alan elektroforez, immunoelektroforez, kapiler elektroforez, iki boyutlu elektroforez gibi farklı elektroforez yöntemleri vardır. Et ve et ürünlerinde proteinlerin tanımlanmasında en belirleyici elektroforez yöntemi, iki boyutlu (2D) elektroforez olarak belirtilmiştir (2,7). Bunun yanında SDS-PAGE yöntemi de yapılan araştırmalarda en çok kullanılmış olan yöntemlerdendir BİLİMSE
2.3.2 İki boyutlu elektroforez İki boyutlu elektroforez (2DE: 2 Dimension Electrophoresis); proteinlerin izoelektrik nokta ve molekül ağırlığına göre, protein karışımlarını ayırmada etkili yöntemlerden biridir. Bu yöntemle proteinler, izoelektriki nokta pH'larına dolayısıyla yüklerine göre duyarlı şekilde ayrıştırılabilirler. Birinci boyutta, yüke bağlı izoelektriki odaklama, ikinci boyutta molekül ağırlığına bağlı elektroforez kullanılır (26).
2.3.3 SDS-PAGE (Sodyum DodesilSülfat - Poliakrilamid Jel Elektroforezi) SDS; anyonik bir deterjan olup iki amino asitte bir peptit zincirine bağlanarak protein moleküllerini oluşturan alt birimleri birbirinden ayırmaktadır. Ayrıca (-) yük taşıdığından peptitlere yüksek oranda (-) yük kazandırır (26). Böylece elektrik yükü açısından karışım içerisindeki bütün protein molekülleri eşit duruma getirilir. Jel konsantrasyonu arttırılarak protein moleküllerinin molekül ağırlıklarına göre ayrışmaları sağlanır. 2.3.4 Kütle spektrometresi Elektroforetik yöntemler moleküler ağırlığı ve izoelektrik noktaları bilinen proteinlerin yarı-kantitatif olarak tanımlanmasını sağlar. Bilinmeyen proteinlerin tanımlanması ve kantitatif sonuç elde etmek için kütle spektrometrik yöntemler kullanılır. Kütle spektrometreleri, manyetik veya elektriksel bir alanda hareket eden yüklü partikülleri kütle/ yük oranlarına göre diğer yüklü partiküllerden ayırt ederek analizleme esasına göre çalışmaktadır (27). Tüm kütle spektrometrelerinin çalışma prensibi benzerdir. Temel olarak, örnek girişi, inlet denilen kısım ve iyon kaynağı, kütle filtresi, detektör bölümlerinden oluşan yüksek vakum sisteminden meydana gelir. Bu ünitelere bağlı bilgisayardan veriler alınır. Kütle spektrometrelerinde farklı iyonlaştırma teknikleri denenmiştir. En önemlileri ESI (Electrosprey Ionisation) (28, 29) ve MALDI (Matrix-assisted Laser Desorption Ionisation) (30) olan hafif (soft) iyonizasyon tekniklerinin bulunması protein tanımlamasındaki MS (Mass Spectrometry: Kütle Spektrometre) uygulamasının başlıca basamaklarını oluşturmaktadır. Moleküller normalde yüklü partiküller değillerdir ve kütle spektrometreleri iyonizasyon işlemi ile molekülleri uyararak yüklü iyonize moleküller haline dönüştürürler. Yüklü moleküller stabil değillerdir ve diğer moleküllerle veya bir yüzey ile temas ettikleri zaman fragmentlerine parçalanır ve yüklerini kaybederler. Oluşan her bir iyon spesifik bir moleküler kütleye ve yüke sahiptir ve m/z d e ğ e r l e r i n i n yoğunluğa karşı gösterildiği bir spektrum ile bileşik olarak tanımlanmaktadır (27). Başlıca iyonizasyon yöntemleri olan MALDI ve ESI, kütle filtresi kısmında, değişik tekniklerle (TOF, Quadropole, İyon kapanı vb.) kombine edilerek proteinlerin tanımlanması analizinde klasik bir yaklaşım haline gelmiştir. Çok farklı kütle spektrometre çeşitleri bulunmaktadır. En önemlileri, MALDI-TOF, ESI/MS, ESI/MS/MS, MALDI-TOF/TOF, Kuadropol (dörtlü çubuk), iyon kapan kütle spektrometre, FT-ICR (Fourier Transform Ion Resonance Cyclotron) ve SELDI (Surface Enhanced Laser Desorbtion Ionisation)'dir.
2.3.5 Mikroçipler İki boyutlu elektroforez ve kütle spektrometre yüksek derecede etkili yöntemler olmasına rağmen, çok düşük miktarlarda bulunan proteinlerin tanımlanmasında zayıf tarafları olabilmektedir. Aynı örnekte tekrarlanan analizlerde protein miktarlarında meydana gelen büyük sapmalar, aslında düşük miktarlarda bulunan peptitlerden kaynaklanabilir (31). Bu nedenle protein tanımlanması analizlerinde yüksek hassasiyetli yöntemlere ihtiyaç duyulmuştur. Mikroçipler bunlardan biridir. Bu yöntemde, immobilize (tutuklanmış) proteinleri kullanarak minyaturize edilmiş katı faz ligand bağlayan sistemler kullanılmaktadır. Mikroçip tekniği ile yüzey üzerinde tanımlanmış bir yerde bulunan belirli bir analit, prob kullanarak analiz edilmektedir. Mikroçip verisinden biyolojik bilginin çıkarılması için pek çok yöntem geliştirilmiştir (32). SOM (self organizing maps: öz düzenleyici haritalar) (33) ve K-anlamlı kümeleme (34), en yaygın kullanılan yöntemlerdir.
2.3.6 Veri analizi ve biyoenformatik Biyoenformatik, sayısal biyolojidir. Patterson'e göre (35), protein tanımlanmasında veri elde etme yeteneği, onları analiz etme yeteneğini aşmıştır. Kütle spektrometresinden elde edilen verilerin değerlendirilmesi ve tanımlanması amacıyla uluslararası veri tabanları oluşturulmuştur. Bu veri tabanlarını kullanabilmek için çok gelişmiş istatistiki yöntemleri içeren bilgisayar yazılımlarını kullanmak gerekmektedir.
2.3.7 Proteinlere dayalı analiz yöntemleri ile yapılan araştırmalar Picariello ve ark. (36), suda çözünür et proteinlerinin tanımlanması için alternatif iki boyutlu elektroforez metodu geliştirmişlerdir. Uyguladıkları yöntemde elektroforezin birinci boyutunu, AUT-PAGE (asetik asit-üre-triton poliakrilamid jel), ikinci boyutunu ise SDSPAGE oluşturmuştur. Araştırmalarının sonucunda; taze domuz etinde ve kuru kürlenmiş domuz eti ürünlerinde, pH 3- 10 ve 6-11 aralığında, klasik 2D IPGSDS metoduna göre, suda çözünür proteinlerin oluşturduğu protein noktalarını, daha geniş bir alanda ve daha yüksek çözünürlük ile gözlemleyebilmişlerdir. Çalışmalarında domuz etinin olgunlaşması esnasında sarkoplazmik proteinlerde oluşan proteolitik süreç MALDITOF peptid kütle parmak izi yöntemiyle izlenmiştir. Araştırmalarının sonucunda, geliştirdikleri AUT-PAGE iki boyutlu elektroforez yönteminin, kuru kürlenmiş domuz ürünlerinde sarkoplazmik proteinlerin basit ayrımında uygun bir yöntem olduğunu belirtmişlerdir. Soltanizadeh ve ark. (37), postmortem olgunlaşma esnasında deve ve sığır etinin miyofibriler fragmantasyonu arasındaki farklılığı tespit etmek için SDS-PAGE elektroforez yöntemini kullanmışlardır. Vallejo- Cordoba ve ark. (38), sığır ve devekuşu etinden elde edilen suda çözünen ve tuzlu suda çözünen proteinleri ayırmak ve tanımlamak için SDS-CE (Sodyum dodesil sülfat- kapiler elektroforez) yöntemini kullanmışlardır. Araştırmalarının sonucunda, sığır ve devekuşu etlerinin suda çözünür protein profillerinin kalitatif ve kantitatif olarak farklılık gösterdiğini ve tür tanımlamasında kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Yapılan bir diğer araştırmada çiğ ve pişmiş et ürünlerinde sakatatların (kalp, akciğer, böbrek, ciğer) tespit edilebilmesi için iki boyutlu elektroforez ve MALDITOF yöntemleri kullanılarak belirlenmiş sakatatların protein profili çıkarılarak her bir doku için spesifik olan proteinler belirlenmiş, iki boyutlu elektroforez tekniği ile bu proteinlerin kontrolü gerçekleştirilerek tüm gıda laboratuarlarında rutin kontrollerde bu metodun yarı kantitatif bir yöntem olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır (39). Luccia ve ark., (40) kuru kürlenmiş hamlarda, suda çözünen ve miyofibriler proteinlerde meydana gelen değişimleri belirlemek için çiğ domuz kaslarından ve farklı olgunlaştırma zamanlarına sahip olan kuru kürlenmiş hamlardan ekstrakte ettikleri miyofibriler proteinleri önce iki boyutlu elektroforez ile analiz etmişler daha sonra ağır zincirli m y o s i n i n proteolizi sonucunda elde edilen iki parçayı MALDI-TOF kütle spektrometresi cihazıyla tanımlamışlardır. Bu çalışmanın sonucunda, iki boyutlu elektroforez tekniğinin et proteinlerinin enzimatik duyarlılığını belirlemek için etkin bir yöntem olduğunu belirtmişlerdir.
2.4. Metabolitlere Dayalı Analiz Yöntemleri Genler proteinlerin sentezinden ve çalışmasından sorumludur. Sentezlenen proteinlerin bir bölümü ise girdikleri kimyasal reaksiyonlar sonucu metabolizmada bazı metabolitlerin oluşumunu sağlarlar. Bu nedenle, incelenen metabolizmada aranan metabolitlerin bulunması, o metabolitin oluşumundan sorumlu protein ve genlerin düzgün çalıştığını gösterir. Kalsiyum bağımlı doğal proteaza, kalpain denir. Kalpainler, et gevrekliğinde anahtar rol oynar. Post-mortem süreçteki kaslarda biyokimyasal ve tüm diğer değişimler normal seyretmekte iken, bu süreçte kalpain aktivitesi düşüktür. Kalpastatin ise; kalpainin inhibitörüdür. Callipyge koyunu gevrek olmayan (çok sert) bir ete sahiptir. Callipyge koyunun etinde, diğer koyun ırklarının etine göre yüksek miktarlarda kalpastatin bulunur (2).
2.4.1 Metabolitlere dayalı analiz yöntemleri ile yapılan araştırmalar Geesink ve ark, (41) kalpastatinin tespit edilmesi için yüzey plazmon resonans teknolojisine dayalı bir biyosensör geliştirmişler ve Post-mortem süreçteki depolama esnasında, immünolojik olarak tespit edilebilir kalpastatinin miktarının hızlı bir şekilde azaldığını belirlemişlerdir. Söz konusu araştırıcılar çalışmalarının sonucunda geliştirmiş oldukları biyosensörün, çok sayıda örneğin hızlı analizinde kullanılabileceğini ifade etmişlerdir. Bratcher ve ark., (42) kalpastatinin tespiti için kapiler tüp biyosensör geliştirmişlerdir. Sığır karkaslarından kalpastatin tespiti için; postmortem sürecin 0. ve 48. saatlerinde Longissimus dorsi kaslarını geleneksel yöntemlerle izole etmişler ve bu kas dokularını hem geleneksel laboratuvar yöntemleriyle ve hem de yeni geliştirilmiş kapiler tüp biyosensör yöntemleri yardımıyla Warner-Bratzler kesme kuvveti ve ham protein içeriklerini ölçerek karşılaştırmalar yapmışlardır. Çalışmalarının sonucunda kapiler tüp biyosensör yönteminin kalpastatin ölçümünde daha kesin sonuçlar verdiğini belirtmişlerdir. Zór ve ark., (43) kalpastatin analizi için etkin bir biyosensör geliştirerek, optimize etmişler ve et ekstraktı örneklerinin analizinde kullanmışlardır.
3. SONUÇ Moleküler biyoloji alanındaki gelişmeler, et ve et ürünlerinin kalitesinin belirlenmesinde çok farklı yaklaşımları beraberinde getirmiştir. Ülkemizde et ve et ürünlerinin moleküler biyolojik yöntemlerle analizi ile ilgili sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu yöntemlerin kullanımının yaygınlaşması; et ürünlerinde bulunabilecek zoonoz hastalıkların teşhisi, farklı tür veya dokuların belirlenmesi ile kesimden sonra meydana gelen farklı proteolitik süreçlerin tespiti açısından et ürünlerinin kalitesinin belirlenmesinde rutin gıda denetimlerine fayda sağlayacaktır.
KAYNAKLAR 1. Maltin C, Balcerzak D, Tilley R, Delday M. 2003. Determinants of meat quality: Tenderness. Proceedings of the Nutr. Soc. 62 (2):337- 347. 2. Bendixen E. 2005. The use of proteomics in meat science. Meat Sci 71 138-149. 3. Koç B. 2006. Tüketicilerin gıda ürünlerini satın alma davranışları: Adana ili örneği. Türkiye 9. Gıda Kongresi, 24-26 Mayıs Bolu, Türkiye, 787-790. 4. Ballin NZ, Vogensen FK, Karlsson AH 2009. Species determination- can we detect and quantify meat adulteration? Meat Sci 83 (2):165- 174. 5. Anon 2003. Food Labelling [Amendment] (2003). Food Standarts Agency. England. 6. Anon 2010. Türk Gıda Kodeksi. Et Ürünleri Tebliği (2000/4). Tarım ve Köyişleri Bakanlığı. 10 Şubat 2000 tarih ve 23960 sayılı Resmi Gazete, Ankara. 7. Mullen AM, Stapleton PC, Corcoran D, Hamil RV, White A. 2006. Understanding meat quality through the application of genomic and proteomic approaches. Meat Sci 74 (1):3-16. 8.Nilsson P. Transkriptomik. www.biotech. kth.se/courses/gru/courselist/BB1060/lectures/ HT2009/F17.pdf (Accessed 3 June 2010). 9. Köksal F. 2001. Nükleik Asit Çoğaltma Yöntemleri. Uygulamalı Moleküler Mikrobiyoloji, Durmaz R. (Baş editör), 2. Baskı. Nobel Tıp Kitapları Ltd. Şti. Ankara, Türkiye, s. 15-35. 10. Öğüş A. 2009. DNA Yapısı ve Analizi. Genetik Kavramlar, Öner C( Baş editör), Palme Yayıncılık, Ankara, Türkiye, s. 231-259. 11. Buntjer JB, Lamine A, Haagsma N, Lenstra JA. 1999. Species identification by oligonucleotide hybridisation: The influence of processing of meat products. J of the Sci of Food and Agriculture 79 (1): 53-57. 12. Şakalar E, Abasiyanik MF. 2009. AMolecular Genetic Approach to the Quantitative Analysis of Processed Meat by Real-Time PCR Techniques. 3rd International Congress on Food and Nutrition, 22-25 April, Antalya, Türkiye, s. 152. 13. Laube I, Zagon J, Broll H. 2007. Quantitative determination of commercially relevant species in foods by real-time PCR. Int J of Food Sci Technol 42 (3): 336-341. 14. Janssen FW, Ha¨gele G.H, Buntjer JB, Lenstra JA. 1998. Species identification in meat by using PCR-generated satellite probes. J of Ind Microbiol & Biotechnol. 21, 115-120. 15. Girish PS, Anjaneyulu ASR, Wiswas KN, Shivakumar BM, Anand M, Patel M, Sharma B. 2005. Meat species identification by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) of mitochondrial 12S rRNA gene. Meat Sci 70 (1):107-112. 16. Kesmen Z, Yetim H, Güllüce A, Sahin F. 2009. Identification of meat species by TagMan based real time PCR assay. Meat Sci 82(4): 444- 449. 17. Yetim H, Kesmen Z, Şahin F. 2006. Kayseri ve Erzurum piyasasında satılan et ürünlerinde farklı hayvan türlerine ait etlerin PCR tekniği kullanılarak belirlenmesi üzerine bir araştırma. Türkiye 9. Gıda Kongresi, 24-26 Mayıs, Bolu, Türkiye, 985-988. 18. Ong S.B, Zuraini M.I, Jurin W.G, Cheah Y.K, Tunung R, Chai L.C, Haryani Y, Ghazali F.M, Son R. 2007. Meat molecular detection: Sensitivity of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism in species differentiation of meat from animal origin. Asean Food J 14 (1):51-59. 19. Murugaiah C, Noor Z.M, Mastakim M, Bilung L.M, Selamat J, Radu S. 2009. Meat species identification and halal authentication analysis using mitochondrial DNA. Meat Sci 83 57-61. 20. Soares S, Amaral JS, Mafra I, Oliveira PPMB. 2010. Quantitative detection of poultry meat adulteration with pork by a duplex PCR assay. Meat Sci. 85(3), 531-536. 21. Kesmen Z, Yetim H, Şahin F. 2010. Identification of Different Meat Species Used in Sucuk Production by PCR Assay. GIDA 35(2): 81-87. 22. Öğüş A. 2009. Genetik Şifre ve Transkripsiyon. Genetik Kavramlar. Öner C. ( baş editör), Palme Yayıncılık, s.306-333. 23. Oda SHI, Nepomuceno AL, Ledur MC, Oliveira MCN, Marin SRR, Ida EI, Shimokomaki M. 2009. Quantitative Differential Expression of Alpha and Beta Ryanodine Receptor Genes in PSE (Pale, Soft, Exudative) Meat from Two Chicken Lines: Broiler and Layer. Braz. Arch. Biol. Technol. v.52 n.6: pp. 1519-1525. 24. Li JG, Zhou JC, Zhao H, Lei XG, Xia XJ, Gao G, Wang KN. 2010. Enhanced water-holding capacity of meat was associated with increased Sepw1 gene expression in pigs fed selenium-enriched yeast. Meat Sci. Article in Press. Available online 24 May 2010. 25. Zhang Q, Lee HG, Han JA, Kim EB, Kang SK, Yin J, Baik M, Shen Y, Kim SH, Seo SK, Choi YJ. 2010. Differentially expressed proteins during fat accumulation in bovine skeletal muscle. Meat Sci. Article in Press. Available online 9 July 2010. 26. Arda N, Sarıkaya A, ve Karagöz A. 2003. Protein Analizlerine Genel Bakış. “Proteomics ( Proteomik : Protein Analizinde Yeni Yaklaşımlar)”, Uygulamalı Yaz Eğitimi Kurs Kitabı. İ.Ü. Fen Fakültesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, İstanbul, Türkiye, 184 p. 27. Biberoğlu G. 2003 Kütle spektrometresi ve tıp alanında kullanımı. T Klin Tıp Bil 23: 491- 498. 28. Fenn JB, Mann M, Meng CK, Wong SF, Whitehouse CM. 1989. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science, 246 (4926):64-71. 29. Whitehouse CM, Dreyer RN, Yamashita M, ve Fenn JB. 1985. Electrospray interface for liquid chromatographs and mass spectrometers. Analytical Chem 57 (3):675-679. 30. Karas M. 1996. Matrix-assisted laser desorption ionization MS: Aprogress report. Biochemi Soc Transac, 24 (3):897-900. 31. Celis JE, Kruhoffer, M, Gromova, I, Frederiksen, C, Ostergaard, M, Thykjaer T. 2000. Gene expression profiling: Monitoring transcription and translation products using DNA microarrays and proteomics. Febslet, 480(1): 2-16. 32. Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D. 1998. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci USA, 95 (25), 14863-14868. 33. Tamayo P, Slonim D, Mesirov J, Zhu Q, Kitareewan S, Dmitrovsky E. 1999. Interpreting patterns of gene expression with self-organizing maps: Methods and application to hematopoietic differentiation. Proc Natl Acad Sci USA, 96 (6), 2907-2912. 34. Tavazoie S, Hughes JD, Campbell MJ, Cho RJ, Church GM. 1999. Systematic determination of genetic network architecture. National Genetics, 22 (3): 281-285. 35. Patterson SD. 2003. Data analysis - the Achilles heel of proteomics. Nature Biotechnol. 21: 221-222. 36. Picariello G, Martino AD, Marnone G, Ferranti P, Addeo F, Faccia M, SpagnaMusso S, Luccia AD. 2006. Proteomic study of muscle sarcoplasmic proteins using AUT-PAGE/SDS-PAGE as two-dimensional gel electrophoresis. J. of Chroma. B. 883(1), 101-108. 37. Soltanizadeh N, Kadivar M, Keramat J, Fazilati M. 2008. Comparison of fresh beef and camel meat proteolysis during cold storage. Meat Sci. 80(3), 892-895. 38. Vallejo-Cordoba B, Rodriguez-Ramirez R, Gonzales-Cordova AF. 2010. Capillary electrophoresis for bovine and ostrich meat characterisation. Food Chem.120(1), 304-307. 39. Billet E. 2008. The proteomic detection of offal in meat products. http://www.food. gov.uk/multimedia/pdfs/fraudseminarprot.pdf (Accessed 15 June 2010). 40. Luccia AD, Picariello G, Cacace G, Scaloni A, Michele F, Liuzzi V, Alviti G, Musso SS, 2005. Proteomic analysis of water soluble and myofibrillar protein changes occurring in dry-cured hams. Meat Sci 69(3): 479-491. 41. Geesink GH, van der Palen JGP, Kent MP, Veiseth E, Hemke G, Koohmaraie M. 2005. Quantification of calpastatin using an optical surface plasmon resonance biosensor. Meat Sci 71(3): 537-541. 42. Bratcher CL, Grant SA, Vassalli JT, Lorenzen CL. 2008. Enhanced efficiency of a capillary- based biosensor over an optical fiber biosensor for detecting calpastatin. Biosens Bioelectron. 23(11): 1674-1679. 43. Zór K, Ortiz R, Saatçi E, Bardsley R, Parr T, Csöregi E, Nistor M. 2009. Label free capacitive immunosensor for detecting calpastatin - Ameat tenderness biomarker. Bioelectrochem. 76(1-2): 93-99.