Prof. Dr. Mustafa Karakaya 1, Yrd. Doç. Dr. Mustafa Tahsin Yılmaz 2,
Yrd. Doç. Dr. Cemalettin Sarıçoban 1 , Arş. Gör. Kübra Ulusoy 1
1 Selçuk Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümü, Konya
2 Erciyes Üniversitesi, Safiye Çıkrıkçıoğlu Meslek Yüksekokulu, Kayseri
Özet
Biofilmler gıda hijyen ve sanitasyonu açısından oldukça önemlidir. Biofilmlerin özel öneme sahip olmasının nedeni, uygun şartlar altında mikroorganizmaların gıda ve gıda temas yüzeyleri üzerinde tutunma ve gelişme kabiliyetidir. Biofilm oluşumu dinamik bir prosestir ve mikroorganizmaların yüzeylere tutunma ve gelişmesini içeren farklı bir mekanizmadır. Biofilm tutunma ve kontrolünün daha iyi anlaşılabilmesi ve üzerinde uygun çalışmaların yapılabilmesi amacıyla çeşitli teknikler uygulanmıştır. Eğer mikroorganizmalar temizleme sürecinde gıda temas yüzeylerinden tamamen uzaklaştırılamazsa, biofilm oluşumuna yol açabilir ve bu durum biotransfer potansiyelini de artırabilir. Bu nedenle; hijyenik fabrika düzeni, ekipman tasarımı, malzeme seçimi, fiziksel metotlarla birleşen dezenfektan ve deterjanların seçimi ve doğru kullanımı gibi çeşitli önleyici ve kontrol stratejileri, gıda temas yüzeyleri üzerinde kontrol altına alınabilen biofilm oluşumunu engelleyebilir. Ayrıca, bakteriosinler ve çeşitli enzimler, biofilmlerin etkili bir şekilde biokontrolü ve uzaklaştırılması için gıda endüstrisinde oldukça önemli potansiyele sahiptirler. Yeni bir konu olan biokontrol stratejileri, gıdaların güvenliği, kalitesi ve biofilm serbest sistemlerinin kontrol altına alınması açısından önemlidir.
Anahtar Kelimeler: Biofilm, Hijyen, Biokontrol
THE IMPORTANCE OF BIOFILMS TO FOOD INDUSTRY
Abstract
Biofilms carry great importance in the context of food hygiene and sanitation. The reason is the ability of microorganisms to attach and grow on food and food-contact surfaces under encouraging conditions. Biofilm formation is dynamic process and a different mechanism that is involved with the microbial attachment and growth. Several techniques have been developed to understand the biofilm attachment, control and achieve proper study. If the microorganisms from the food-contact surfaces cannot be completely removed, they may cause to biofilm formation, which increases biotransfer potential. Therefore, in order to control biofilm formation on food-contact surfaces, various preventive and control strategies such as hygienic plant lay-out, equipment design, material selection, correct use and selection detergents and disinfectants combined with some physical methods can be properly applied. Bacteriocins and enzymes have also an unequalled potential to perform effective biocontrol and remove biofilms. These new biocontrol strategies are important with respect to food safety, quality and maintenance of biofilm-free systems.
Key words: Biofilm, Hygiene, Biocontrol
GİRİŞ
Tabiatta ve gıda hammaddelerinde doğal olarak bulunan mikroorganizmalar, yaşamaları ve gelişmeleri için gerekli olan besin maddeleri, iyonlar ve diğer organik materyaller vasıtasıyla katı yüzeylere kir formunda tutunurlar. Eğer oluşan “kir” tutunduğu yüzeyden uzaklaştırılmazsa, sonuçta meydana gelen biofilm yapısı ekipmanların yüzeyinde ve boru hatlarında birikecektir. Biofilm (koruyucu ve yapışkan bir matriksin boşaltılmasıyla gözlenen mikroorganizmaların kompleks bir yapıda toplanması) ve biobirikim (mikroorganizmaların arzu edilmeyen şekilde birikmeleri) temas yüzeyleri üzerine biyolojik tutunmayı ve gelişmeyi ifade eden iki terimdir. Biobirikim terimi, meydana gelen filmin zararlı olduğunun düşünüldüğü durumlarda kullanılan bir terimdir (1). Biofilmler; hem mikroorganizmalardan ve hem de onların oluşturduğu polimerik maddelerden (EPS), genellikle de polisakkaritlerden meydana gelir (2). Biofilm oluşumu, mikroorganizmaları zararlı çevrelerden korur ve besin maddeleri içinde tuzak görevi yapar.
Biofilm oluşumu gıda endüstrisinin birçok sektöründe sorunların ortaya çıkmasına yol açar. Biofilm oluşumu; gıda işletmelerinde ve atık su dağıtım sistemlerinde dikkate değer öneme sahiptir. Bu nedenle gıda temas yüzeylerinin temizlik ve dezenfeksiyonunda, mikrobiyal materyalin ortamda birikmesini engellemek önemlidir. Biofilm oluşumu, gıda endüstrisiyle birlikte birçok sahada önemli problemlere sebep olur. Çevresel, evsel ve endüstriyel ortamlarda yerleşik (sessile) organizmalar baskındır. Boruların iç cidarları üzerinde oluşan biofilm tabakası, akış sistemleri boyunca azalan bir akışa neden olur. Yüzeylerde toplanan canlı organizmaların artmasının sonucu olarak ısı iletimi azalabilir, ürüne kontaminasyon oluşabilir ve biofilm tabakasındaki mikroorganizmaların asit üretimi nedeniyle borular aşınabilirler. Gıda işletmelerinde oluşan biofilm tabakaları ekipmanların mikrobiyal kontaminasyonuna neden olabilir (3, 4).
Mikroorganizmaların ıslak yüzeylere tutunmaları, çoğalmaları ve ürettikleri ekstraselüler polimer bileşenlerden oluşmuş matriks içerisine yerleşmeleri doğal bir durumdur. Biofilmler özellikle gıda endüstrisinde mayalanma, süt ürünleri işleme, kanatlı etleri işleme ve kırmızı et işlemede sorun oluşturabilirler (5-8). Gıda endüstrisi içerisinde, süt işleme ekipmanlarında biofilm oluşumu, önem arz eden bir sorundur. Özellikle süt ürünlerinde kontaminasyon meydana geldiğinde, sorunun kaynağı biofilmlerle ilişkilendirilir (9-11). Biofilmler, planktonik hücrelerle karşılaştırıldığında antimikrobiyal maddelere çok daha fazla dirençlidir (10, 11). Süt endüstrisi ekipmanları üzerinde biofilm oluşumu, gıda zehirlenmesi ve ekipman bozulması yüzünden ciddi hijyen sorunlarına ve ekonomik kayıplara yol açabilmektedir (12, 13).
Oluşan biofilm tabakası yüzeyden ayrıldığında serbest kalan mikroorganizmalar kolayca dağılabilirler. Bu mikroorganizmalar, et endüstrisinde öncelikle uygun olmayan temizlemenin bir sonucu olarak çiğ ette ciddi kontaminasyonlara neden olurlar. Örneğin, kanatlılara Salmonella, Campylobacter, Yersinia enterocolitica, Staphylococus aureus ve Listeria’ nın bu şekilde kontamine olduğu belirlenmiştir. Bu durum, biofilm oluşumunu önlemede et endüstrisinin karşılaşabileceği sorunu ortaya koymaktadır. Bununla birlikte, dekontaminasyon işlemlerinin hem atlanmış hem de etkisiz olduğunu da göstermektedir. Kontamine olmuş çiğ bir et sağlık açısından risk taşır. Eğer kontamine olmuş bu çiğ et uygun bir şekilde pişirilmemiş ve ekipmanlara da kontamine olmuşsa, hastalık riski taşıyan böyle bir gıdada aynı zamanda sağlık riski de devam eder (4).
Pseudomonas ve Staphylococcus türleri gıda endüstrisinde en yaygın şekilde biofilm oluşturmaktadırlar (14). Et yüzeylerine kontamine olabilen bakteriler arasında ise L. monocytogenes, Micrococcus spp., Staphylococcus spp., Clostridium spp., Bacillus spp., Lactobacillus spp., Brochothrix thermosphacta, Salmonella spp., E. coli, Serratia spp., Pseudomonas spp. ve Acinetobacter spp. sayılabilir (15, 16).
Floyd ve ark.(17) tarafından kanatlı eti işletmelerinde, yapılan bir çalışmada, soğutma tankı ve haşlama tankında oluşmuş biofilmden C. jejuni, Salmonella spp., S. aureus, E. coli izole etmişlerdir. Kanatlı karkaslarının kontaminasyonun da haşlama ve soğutma tanklarının önemli olduklarını ortaya koymuşlardır. Bu derlemede, biofilm oluşumu, gelişimi ve kontrolünü de içeren bazı temel kavramlar üzerinde durulacaktır.
Biofilm nedir?
Biofilmler, bir yüzeye veya herhangi bir ortama yapışan bakteriyel popülâsyonlar olarak tanımlanırlar. Bu tanıma; kümeleşme (toplanma), tabakalaşma veya mikrobiyal popülâsyonun membran gözeneklerine yapışması da dâhil edilir (4, 18, 19). Biofilmler; uygun koşullar altında çürükçül ve patojen mikroorganizmaları da içeren tüm mikroorganizma tipleriyle oluşabilirler (20). Bazı bakteriler biofilm oluşturmak yönünde daha fazla eğilime sahiptirler. Bu bakterilerin en yaygınları Pseudomonas, Enterobacter, Flavobacterium, Alcaligenes, Staphylococcus ve Bacillus’ lardır (3, 4).
Biofilmler, besin maddelerinin bol miktarda bulunduğu pek çok ekosistemde ve tüm yüzey tipleri üzerinde oluşabilirler. Mikroorganizmalar gelişme safhalarına göre; planktonik ve yerleşik olmak üzere iki gruba ayrılabilirler (21). Planktonik safhada mikroorganizmalar; bireysel serbest kayan organizmalar olarak yaşarlar, oysa yerleşik safhada biofilm oluşturan ve sıkıca bir araya gelmiş topluluk olarak görev yaparlar ve bir yüzeye tutunurlar. Mikroorganizmalar; yerleşik organizmalar olarak yaşamayı tercih ederler, çünkü bu şekilde oluşturacakları eksopolisakkarit (EPS) matriksi ile anti-mikrobial maddelerden korunabileceklerdir (4).
Bakterilerin bulundukları yüzeye tutunmaları (adhezyon) zamana bağlı bir oluşumdur. Bu durum dönüşümlü (reversible) ve dönüşümsüz (irreversible) olmak üzere iki basamakta incelenebilir (15, 22, 23). Dönüşümlü basamakta, bakteri hücresi yüzey ile tam olarak temas etmemekte ancak bakteri hücresi ile yüzey arasında uzun mesafeli etkileşimler meydana gelmektedir. Bunlar elektrostatik güçler, hidrofobik etkileşimler ve Van der Walls güçleri olup zayıf etkileşimlerdir. Hücreler bu fazda, durulama gibi basit yıkama işlemleri ile kolayca uzaklaştırılabilirler. Dönüşümsüz basamakta ise yüzeyle kısa mesafeli etkileşimler olan dipol-dipol etkileşimi, hidrofobik etkileşimler, iyon-dipol etkileşimi, iyonik ve kovalent bağlar ve hidrojen etkileşimleri oluşmaktadır. Bakteri hücreleri kamçı (flagella) ve pili (fimbriae) gibi organelleri ile ve EPS (eksopolisakkarit matriks / ekstraselüler polimerik madde) oluşturarak, bulundukları yüzeylere dönüşümsüz olarak bağlanabilirler. Ancak EPS oluşturmayan bazı bakteri türlerinin de yüzeylere bağlanabildiği belirtilmektedir (14). Dönüşümsüz basamakta, hücrelerin yüzeylerden uzaklaştırılması fırçalama ve kazıma gibi güçlü temizleme işlemlerinin yapılmasını gerektirmektedir.
Biofilm Oluşumu-Bakteriyel Tutunma
Biofilm, dinamik ve kompleks bir ortamdır. Şekil 1’de görüldüğü gibi genel olarak biofilm oluşumu mikroorganizmaların yüzeye tutunması, kolonizasyonu ve gelişimi aşamalarını içerir (24). Mikrobiyal biofilmler; yoğun bir şekilde hidrate edilmiş EPS’ in geniş bir ağ şeklinde üretimiyle kısmen karakterize edilirler. Biofilm tabakasındaki bakterilerin EPS üretimi pek çok fonksiyona hizmet eder. Bunlar; başlangıçta bir yüzeye bakterilerin tutunmasını kolaylaştırılması, mikrokoloninin oluşumu ve devamlılığı ile biofilmin yapısı; çevresel etkiye ve anti-mikrobiyal maddelere karşı gelişmiş biofilm direncidir. Sonuçta oluşan EPS-matriksi besin maddelerini yakalamak için bakterilere imkân sağlar (18).
Şekil 1. Biofilm oluşumu (Kaynak 18’den derlenmiştir)
Mikroorganizmaların hücre duvarlarındaki polisakkaritler fimbria ve EPS-matriksi; hücre ve kolonileşmiş yüzeyler arasında bir köprü oluşturabilir (25). Oluşan EPS-matriksi, yüzey enerji yükünü ve yüzey üzerindeki serbest enerjiyi değiştirir. Ayrıca oluşan EPS-matriksi bulunduğu çevreye karşı bir bariyer olarak ve biofilm yapısının stabilitesini sağlayıcı olarak da görev yapar (3, 4). Bazı mikroorganizmalar biofilmin doğal yapısı üzerinde etkiye sahip olan EPS-matriksi içindeki iyonlara da bağlanabilirler. Bakteriyel ekstrasellüler polisakkaritler; homo ve heteropolisakkaritler özellikle glukoz, fruktoz, mannoz, galaktoz, purivat ve mannuronik asit veya glukoronik asit temelli komplekslerden oluşur (4, 25). Bağlayıcıların farklı tipleri EPS-matriksinin yapısını tamamen etkileyen bu monomerler arasında mevcuttur. Mikroorganizmalar tarafından üretilen eksopolisakkaritler (EPS); mikroorganizmaların Gram (+) veya Gram (-) olup olmamasına bağlı olarak da değişir. Ayrıca, EPS mikroorganizmaların fizyolojik safhalarına da bağlıdır (4).
Biofilmin mikrobiyal hücreler ve EPS ana iskeletinden oluştuğu, EPS’nin toplam organik karbonun %50-90’ını barındırarak ana maddeyi (matriks) oluşturduğu kabul edilmiştir. EPS; kimyasal ve fiziksel olarak değişkenlik gösterse de öncelikli olarak polisakkaritlerden oluştuğu, polisakkaritlerden bir kısmının doğal, bir kısmının da anyonik yapıda olduğu ortaya konmuştur. Üronik asitlerin (D-glukoronik, D-galakturonik ve mannuronik asitler) veya ketal bağlantılı piruvatların bu yapıya anyonik özellik kazandırdığı bildirilmiştir (26).
Yüzeye yapışma; zamana bağlı bir prosestir ve kabaca geri dönüşlü ve geri dönüşsüz fazlar şeklinde ikiye ayrılabilir (27). Geri dönüşlü fazda, mikroorganizmalar yüzeye yakındır, fakat yüzeyle gerçekte temas halinde değildirler. Aslında bu fazda çeşitli uzunluk ve mesafe interaksiyonları (elektrostatik, hidrofobik interaksiyonlar ve Van der Walls kuvvetleri) geri dönüşümü etkiler. Geri dönüşümsüz fazdaki interaksiyonlarda mikroorganizmalar yüzey bitimine bağlanırlar. Bu fazda; dipol-dipol, hidrofobik, iyon-dipol, kovalent bağlar ve hidrojen interaksiyonunu içeren çeşitli kısa aralıklı kuvvetler fazı etkiler (27, 28, 29). Mikroorganizmalar geri dönüşümlü şekilde yüzeye bağlanırken, bir taraftan da yaşamlarını sürdürebilmeleri için yüzeyde yeterince besin maddesi olup olmadığını belirlemeye çalışırlar (28, 29).
Boru ve ekipmanların üretildiği malzeme, uygun bir yüzey oluştuğunda ortamdaki organik materyal ve iyonları çeker. Bu yüzeylerde besin maddelerinin birikimi oluşur. Çünkü pek çok katı yüzey suya daldırıldığında bu yüzeylerin açıkça negatif bir yük taşıdığı farz edilir (1). Sonuçta, katyonlar ve makromoleküller ile kolloidal materyallerin çeşidi, boru-su ara yüzeyini cazip hale getirir. Mikroorganizmalar organik materyale ilk önce geri dönüşümlü olarak ve daha sonrada kamçı ve fimbriaları vasıtasıyla geri dönüşümsüz olarak bağlanırlar. Mikroorganizmaların çevresindeki besin maddeleri sınırlandığında da alt tabakaya tutunurlar. Biofilm tabakasında bulunan hücreler eğer besin maddesi yokluğundan ölecek olurlarsa bu taktirde biofilm tabakası yerinden sökülebilir. Bu durum ortamdaki hücre sayısında azalma sonucunu doğurur. Mikroorganizma hücreleri bulundukları ortamda tekrar yeterli besin maddeleri mevcut olduğunda normal hücre sayısını yeniden kazanırlar. Besin maddeleri dışında, yerleşik hücre miktarını etkileyen diğer faktörler; pH, sıcaklık, EPS ve kamçı içeren hücre yapısı, gelişme fazı ve besin maddesi içeriğidir (4). Yerleşik hücrelerin başarılı bir şekilde gelişimi muhakkak ki hızlı gelişme anlamına gelmemektedir.
Tutunmanın karmaşık prosesi sürecinde mikroorganizmalar, yüzeye yakınlıklarına tepki olarak fenotiplerini değiştirirler (18). Başarılı bir form oluşturmak için yerleşik mikroorganizmalar çevreden besinlerini almak ve çok kompleks organik maddeler için bir parçalama sistemi geliştirmek zorundadır. Basit parçalara ayırma sistemi çeşitli farklı türler arasında genelde bir işbirliği ile gerçekleşir (30). Çevreden besinleri almaya ilaveten, organik asitler gibi metabolik ürünler biofilm içinde tutularak da oluşabilir. Zaman zaman bu, mikrobiyal heterojenliği etkileyen ve korozyon veya sindirimle boru yüzeylerini ciddi bir şekilde etkileyen bitişik mikrokolonilerde önemli bir farklılığa yol açarlar (4).
Biofilmler sıklıkla borulardaki çatlaklarda, köşelerde, contalarda, bağlantılarda ve kırıklarda veya boru sistemindeki çıkmazlarda bulunurlar (3, 4). Borularda oluşan biofilm eğer zamanında uzaklaştırılmazsa, filmin kalınlığı akış hızını değiştirebilir. Biofilm oluşumundan kaçınmak için başlangıçta doğru materyal ve temizleme metotlarını seçmek önemlidir (3). Eğer doğru malzeme önceden planlanmazsa ve yanlış yüzey malzemelerinin seçimi yapılırsa sonuçta sürpriz bir şekilde yanlış seçilen malzeme dizaynının pahalı olduğunun göstergesi olarak ortaya çıkabilir. Yüzey malzemeleri pürüzsüz ve iyi şartlarda (çatlaksız ve ölü noktasız) ise, yüzeyleri kolayca temizlenirler.
Biofilm oluşumu ve bakterilerin yüzeylere bağlanma düzeyi; ortamın pH’ı ve sıcaklığı, bakteri türü, bakteri hücre duvarının yapısı [Gram (+) veya Gram (-) oluşu], bakteri sayısı, bağlandığı yüzeyin özellikleri, hücre hareketliliği, ortamdaki besin içeriği ve miktarı, iyonik konsantrasyon gibi bir çok faktör ile değişebilmektedir (22, 23, 31, 14, 15, 32-36). Bazı çalışmalarda kamçılı bakterilerin, kamçısız bakterilere göre yüzeylere daha kolay bağlandığı belirtilirken, bazı çalışmalarda bu yönde önemli derecede bir fark bulunmadığı ifade edilmiştir (33, 37).
Gıda endüstrisinde kullanılan yüzey malzemeleri arasında paslanmaz çelik, cam, polimerler, alüminyum, bakır, kauçuk, demir döküm ve formika sayılabilir. Yüzey özelliklerine bağlı olarak bakteriyel bağlanma düzeyinin değişebildiğini gösteren çeşitli çalışmalar vardır (31, 16, 32, 34, 35, 36). Bu çalışmalarda mikroorganizmaların hidrofobik malzemelere (plastik ve kauçuk gibi), hidrofilik malzemelerden (paslanmaz çelik ve cam gibi) daha yüksek düzeyde bağlandığı belirtilmektedir. Bakteriyel tutunma ve biofilm oluşum düzeyinin en az olduğu materyal olarak paslanmaz çelik gösterilmekte ve bu nedenle gıda işletmelerinde gıda ile temas eden yüzeylerde bu materyalin (özellikle AISI 304 tipi) kullanımı önerilmektedir. Ayrıca paslanmaz çelik yüzeyler cam gibi kolayca temizlenebilmektedir. Buna karşılık bazı çalışmalarda kauçuktan yapılan malzemelere bağlanmanın paslanmaz çelik ve diğer yüzeylerden daha az olduğu ve kauçuğun yapısında bulunan sülfür ve çinkonun antimikrobiyal özelliklerinden dolayı mikrobiyal gelişimi inhibe ettiği belirtilmiştir (31). Yine aynı çalışmalarda demir, manganez ve kalsiyum gibi elementlerin, bakteriyel bağlanmayı kuvvetlendirdiği bildirilmiştir.
Yüzeylerin Kolonizasyonu
Bir ekipman yüzeyinin kolonizasyonu çevrede mevcut mikroorganizmaların karışımına bağlıdır. Bir tek kültürde bile, hücreler farklı yollarla tutunabildiği için tutunmada bazı heterojenlikler olabilir. Bir türden daha fazlası mevcut olduğunda, bazı mikroorganizmalar yeni bir biofilm başlatabilen kolonileşmemiş alanlara tutunurken, kolonileşen diğer mikroorganizmalar mevcut biofilme bağlı olacağı için farklı olabilir (4). Tutunmanın başlangıcında, yapışma bölgeleri uniform bir yüzey üzerine rastgele lokalize olurlar. Kolonizasyon başladığında, bu bölgeler bakteriyel aktivite nedeniyle farklılaşmaya başlar (4, 18). Yüzey gelişimi, replikasyon, mikrokoloni formasyonu ve biofilm matriks üretiminin (EPS) tümü tutunma bölgelerinin heterojenliğini artırır.
Biofilm gelişimi için, polimer matriksinde kapsüle olmuş mikroorganizma sayısında bir artış meydana gelir. Bu durum biofilmin yapısını belirlemede önemli bir faktördür. Mikroorganizmaların lokalizasyonuna bağlı olarak, bazı mikroorganizmalar hücre bölünmesi için gerekli olan oksijen, besinler veya ortamı tüketebilirler. Bir biofilmdeki mikroorganizmaların çoğu aerobiktir fakat ortamda anaerobik mikroorganizmalar da mevcuttur. Oksijen konsantrasyonunun artması / azalması, su-biofilm ara yüzeyinde veya yakınında olan aerobik mikroorganizmalar tarafından hızla kullanılması sonucu biofilmde gelişir. Oksijen yetersizliği, anaerobik koşulların hâkim olduğu ve fermentatif bakterilerin özellikle ortama hâkim olduğu oksijensiz bir bölgenin oluşumuna yol açar (4). Bir biofilmdeki bazı mikroorganizma popülâsyonları, diğer türler tarafından oluşturulan ikincil ürünleri kullanırlar. Anaerobik mikroorganizmalar, metal korozyon problemlerine yol açabilen sülfatı indirgeyen bakterilerin gelişmesini teşvik eden karbondioksit ve hidrojen ürünleri kadar düşük molekül ağırlıklı organik ve yağ asitlerini de oluştururlar (3, 4, 19). Bir biofilmde mikroorganizmaların yaşama sürecinin yan etkilerinden biri besin maddeleri ve diğeri ise oksijen için rekabettir (20).
Biofilm içinde gelişen ve alt tabakaya yapışan mikroorganizmaların, planktonik hücrelere göre antibiyotik ve dezenfektanlara daha dirençli olduğu görülmüştür. Bu mikroorganizmaların direnci metabolik aktivitelerine bağlıdır ve bu durum biofilmin yaşı ile artar (3, 4, 18, 38, 39). Biofilm tarafından sergilenen bu antimikrobiyal direnç; üç boyutlu yapıyla ilişkilidir ve bu yapı bozulur bozulmaz direnç kaybolur (40). Antibiyotik dirençteki artışa ilaveten biofilm; aşırı ısı, ışık ve kurumaya karşı da artan bir dirence sahiptir (18).
Biofilmlerin Yapısı ve Uzaklaştırılması
Biofilmler pek çok çevre tarafından geçmişte sert bir yapıya sahip oluşumlar olarak algılanmıştır. Son zamanlarda yapılan birçok çalışmada biofilmlerin; su ve besin maddelerinin içerisinde dağıtıldığı kapillar su kanalları ile gözenekli bir yapıya sahip olduğu görülmüştür (18). Biofilmin yapısı ve görüntüsü; farklı türlerin tipi, sayısı ve onu çevreleyen ortamdaki akış hızına bağlıdır (3, 18). Tek bir kültür tarafından oluşturulan bir biofilmin karmaşık görüntüsü Şekil 3’de verilmiştir. Su kanallarının, mikrokolonilerin hem altında hem de arasında olduğu görülebilmektedir.
Biofilmlerde canlı hücrelerin dağılımı, hücre toplanmaları, ekstraselülar polimerler ve su kanalları sürekli olarak değişim gösterir. Biofilmin görüntüsü tek kültürler için türe ve çoklu-kültürler için alt-türlere özeldir. Heterojen biofilmlerde, görüntü farklı mikroorganizmaların gelişmesinin ve yüzeylere tutunma örneklerinin bir sonucu olarak genellikle düzensizdir (Şekil 3). Bu görünüm biofilmdeki mikroorganizmaların işbirliğinin bir göstergesidir. Bir biofilmin kalınlığı ortamdaki akış hızına bağlıdır. Biofilmlerin maksimum kalınlığı; katmanlı ve dalgalı akış arasında oluşturulur. Katmanlı bölgedeki kalınlık, alt tabakaya erişebilirliğe ve dalgalı bölgedeki aşınmaya bağlıdır (18). Biofilm ortamındaki hücre yoğunluğu; kentsel su dağıtım sistemleri içindeki oligotrofik aşırı derecede seyrek topluluklardan (1x101 ile 2.2x106 kob/cm2) lağım sistemlerindeki santimetreye varan kalınlıktaki sulu çamur örtülerine kadar değişim gösterir (20).
Mikroorganizmalar; gelişimleri için uygun organik ve inorganik maddelerin kir olarak biriktiği temas yüzeylerinde, özellikle de yüzeylerdeki çıplak gözle görülemeyen çizikler ve aşınmış bölgeler içine yuvalanarak yerleşmekte ve birbirlerine ve yüzeylere bağlanarak biofilm tabakalarını oluşturmaktadırlar. Biofilm tabakaları genellikle yüzeylere çok sıkı bir şekilde tutunmakta ve normal temizlik ve dezenfeksiyon işlemleriyle yüzeylerden uzaklaştırılamamaktadırlar. Böylece biofilm tabakasındaki mikroorganizmalar olumsuz çevre koşullarına karşı zamanla daha dirençli hale geçmekte ve bu ortam içinde canlılıklarını sürdürebilmektedirler (22, 23, 31). Yüzeylere mikrobiyal bulaşma ve sonrasında oluşan biofilmler, pek çok farklı ortamlarda karşımıza çıkmaktadır. Biofilmlerin dirençli fenotiplerinden dolayı yok edilmeleri çok zordur. Bununla birlikte konvansiyonel temizleme ve dezenfeksiyon kuralları, etkisiz biofilm kontrolüne ve biofilmlerin dayanıklılığının yayılmasına da katkı sağlayabilmektedir (41).
Proses ekipmanı ve yüzeylere mikrobiyal tutunma gıda endüstrisinde oldukça yaygındır. Bir biofilm tabakasının oluşumu birkaç günden birkaç haftaya kadar zaman alabilir. Bu nedenle herhangi bir ortamda ilk olarak biofilm oluşumundan kaçınmak için etkin bir temizleme yöntemine sahip olmak veya kullanmak çok önemlidir (4). Biofilm oluşumunu engellemek için en etkin yol; mikroorganizmaların optimum gelişmelerinin farklı olduğu işlem koşullarını seçmektir. Etkili temizleme metotları; ortamda bulunan mikroorganizmalara karşı etkili olduğu bilinen bir deterjanı gerektirir. Pek çok durumda ekipman yüzeylerinin temizlenmesinde, iki veya daha fazla yöntemin kullanılması faydalı olabilir. Çünkü mikroorganizmalar canlılıklarını sürdürebilmek için tüm teknik koşullara uymak zorundadırlar. Biofilm oluşumundan meydana gelen pek çok sorun; makine ve ekipmanların tasarımında hijyenik bir dizaynın seçilmesiyle azaltılabilir veya elemine edilebilir. Ortamda biofilm varlığı tespit edildiğinde derhal müdahale gereklidir. Bu müdahale mekaniksel durulama veya klorin / monokloramin ile şok muamele şeklinde olabilir (3). Etkili bir temizleme yöntemi veya durulama işlemi kullanılarak mikroorganizmalara baskı yapılması bazı durumlarda biofilm oluşumunu teşvik edebilir. Örneğin; klorlama işlemi, biofilmde bazı Pseudomonas türlerinin gelişimini teşvik edebilir (3, 4).
Yerinde temizlik sistemleri (CIP) biofilm oluşumunu engellemek için tasarlanmış olmasına karşın bazı durumlarda uygun tasarlanmış sistemler yardımıyla da biofilm oluşumu engellenebilmektedir (3). Deterjan ve temizleme yüzeyleri arasındaki temas süresinin artışının mikrobiyal yükteki azalmaya katkı sağladığı bildirilmiştir. Temizlik tamamlandıktan sonra işleme ekipmalarının sık sık temizlenmesi ve kurulanması biofilm tabakasına yerleşme teşebbüsünde bulunacak mikroorganzimalara karşı diğer bir önemli engeli oluşturur (4).
Aşırı sıcaklıklara, ışık ve kurumaya karşı oluşan direnç, bir biofilmin yapısındaki mikroorganizmalar için de artış gösterir (42). Temizleme maddeleri ve antibiyotiklere karşı oluşan bu direnç; biofilmin yaşı, EPS matriksinin durumu, alt tabaka ve gelişme şartlarıyla da artış gösterir (28, 43). Bu koşullar biofilm yapısını hızlı bir şekilde yok etmek açısından önemlidir. Biofilm oluşumunun önlenmesi, sık sık temizleme işlemi ile başarılabilir. Ürün işleme sıcaklığına bağlı olarak biofilm oluşumunu önlemek için, yaklaşık 8 saat aralıklarla temizleme yapılmalıdır (3, 28). Teorik olarak daha önce oluşan biofilmlerin uzaklaştırılması daha yeni oluşan biofilmleri uzaklaştırmaya nazaran daha güçtür. Çünkü yeni oluşan biofilmler alt tabakaya sıkıca bağlanma zamanı bulamamışlardır (3, 28, 44).
Biofilmler; yapışmaya neden olan ve organik materyalin temizlenmesi işlemleri kullanılarak ortamdan uzaklaştırılabilirler. Bu işlemden sonra dezenfektanlar, yüzeydeki mikroorganizmaları inaktive etmek/öldürmek için veya tam ayırmadan sonra sistemi temizlemek amacıyla kullanılırlar (1, 28). Eğer temizleme yeterli değilse, polimer tabakası boyunca geçiş olmadığından etkisiz bir dezenfektan sonucunda ortamda organik maddeler kalacaktır. Bu nedenle temizleme işlemi, mikroorganizmaları uzaklaştırmak veya inaktive etmek için bir sanitasyon önceliği olmalıdır (3, 28).
Doğru sanitizerler ve deterjanların kullanımına ilaveten personel iyi gıda üretim uygulamaları (GMP) konusunda mutlaka eğitilmeli ve bilgilendirilmelidir. Personel biofilm oluşumunu fark edemezse ciddi sonuçlara sebep olabilir. Çünkü oluşabilecek biofilm tabakaları infeksiyon ve hastalıklara sebep olan organizmaları içerebilir. Gıda endüstrisinde biofilm oluşum alanlarını mümkün olduğunca sınırlamak amacıyla, HACCP veya Kalite Güvence ve Kontrol Sistemlerinin kullanımı uygun olabilecektir (3).
Enzimler, biofilm yapıyı tahrip etmek amacıyla kullanılabilirler. Biofilmlerdeki ekstrasellular polisakkaritlerin heterojenliği nedeniyle, farklı enzim aktivitelerinin bir karışımı bakteriyel biofilmin yeterli şekilde tahrip edilmesi için gerekli olabilir. Bakteriyel biofilmlerin uzaklaştırılmasında enzimlerin kullanımı hala sınırlı düzeydedir. Bu durumun nedeni, bu amaçla günümüzde kullanılan kimyasalların kısmen düşük maliyetlere sahip olmasıdır. Zira farklı enzimlerin aktivitelerinin düşük ticari kabul edilebilirliği, onların kullanımını sınırlandırmaktadır (25).
Biofilm oluşturan bakteriler, planktonik hücrelere göre sıcaklık, ışık, kuruma gibi olumsuz çevre koşulları ile antibiyotik ve dezenfektanlara karşı daha fazla dirençlidirler. Planktonik hücreler bulundukları ortamda antimikrobiyal maddelerle her bir farklı açıdan, biofilm oluşturan hücreler ise sadece tek bir açıdan karşı karşıya gelmektedirler (22, 23, 31, 14, 16, 32, 33, 36). Biofilmler; temizlik ve dezenfektan çözeltilerinin difüzyonunu ve iç kısımlardaki hücrelere nüfuz etmesini engeller. Biofilm oluşumu sırasında hücreler tarafından oluşturulan EPS matriksleri aynı zamanda difüzyon bariyeri ve adsorbant görevi de görürler. EPS matriksleri mikrobiyal gelişimi engelleyen katyonları, toksik metal iyonları ve biofilm ile temas eden bazı maddeleri bağlamaktadırlar. Ayrıca su tutma kapasitesi yüksek jeller oluşturarak da bakterilerin susuzluğu karşı dirençlerini arttırırlar (14).
Biofilmler bu özelliklerinin yanı sıra antimikrobiyal maddelerin parçalanmasına neden olan enzimleri üreterek bu maddeleri etkisiz hale de getirebilmektedirler. Biofilmlerin antimikrobiyal maddelere karşı dirençleri, biofilm yaşının artmasıyla doğru orantılı olarak artmaktadır. Bu nedenle yüzeylerde biofilm oluşumunun kısa sürede önüne geçmenin ve gerekli önlemleri almanın da ayrı bir önemi vardır. Biofilmlerde bakteri hücrelerinin EPS oluşturarak meydana getirdikleri üç boyutlu matriks yapı bozulduğunda antimikrobiyal maddelere karşı dirençleri azalmakta veya kaybolabilmektedir. Bu nedenle, gıda işletmelerinde uygun aralıklarda işletmeye uygun ve etkili bir temizlik işlemi uygulanarak mikroorganizmaların tutunabileceği organik maddeler ortamdan uzaklaştırılmalı ve bu işlemi etkili bir dezenfeksiyon uygulaması izlemelidir (45).
Biofilm Oluşumunun Çeşitli Sonuçları
Biofilm oluşumunun etkisi farklı çevrelerde (soğutma suyu sistemleri, gıda işleme endüstrisi, kâğıt endüstrisi vb.) farklı sonuçlara yol açabilir. Farklı konularda uzmanlaşmış meslek gurupları (Ör; mikrobiologlar, mühendisler, çevrebilimciler ve kimyacılar) farklı endüstrilerde ve tıp dünyasında biofilm oluşumuna ve mikrobiyal gelişmeye özel bir ilgi duymaktadırlar. Biofilmler; tuvaletlerde, küvetlerde, endüstriyel su sistemlerinde ve medikal aletlerde olmak üzere, hemen her ortamda oluşabilir. Biofilmler enerji kaybına ve soğutma kulelerinin ve su depolarının, borularının kuşatılmasına sebep olabilirler. Ayrıca, proses ekipmanının korozyonu ve ısı iletimindeki değişimler, biofilm oluşumunun bir sonucu olarak gözlenmektedir (3). Örneğin insanlar için patojen olan Legionella, klimaların su soğutma sistemlerinden izole edilmiştir. Eğer klima sistemleri düzenli bir şekilde temizlenmezse, klimaların ürettiği hava sağlık açısından riske neden olacaktır (3, 4).
Biofilm Tespitinde Kullanılan Yöntemler
Gelişme ortamında oldukça fazla besin maddesine ihtiyaç duyulduğundan, laboratuvar koşullarında mikroorganizmalar tarafından biofilm elde etmek zordur. Ortamdaki besin maddeleri sınırlandırıldığında, mikroorganizmalar biofilmler oluşturabilirler ve bu durumda mikroorganizmalar için temel amaç çevrelerindeki besin maddelerini ele geçirmektir (4). Günümüze kadar “Robbin aparatı” en popüler laboratuar analiz yöntemi olarak kullanılmıştır. Modifiye edilmiş Robbin aparatı kullanılarak kapalı bir sistemde küçük parçalar üzerinde biofilm oluşturmak için mikroorganizmaları geliştirmek mümkün olmuştur. Bu parçalar daha sonra, örneğin bir borunun yüzeyini sembolize etmek amacıyla kullanılabilir. Temizleme işleminden sonra parçalar ve biofilm birbirinden ayırt edilir ve böylece ortamdaki biofilmin miktarı belirlenebilmektedir (46).
Biofilm oluşumunun tespiti için kullanılan yöntemlere “Standard Plate-Count” kullanım yöntemi de dâhil edilmektedir. Bu yöntem biofilmdeki mikroorganizmaların sayısının doğru tahminini vermez. Bu nedenle “Standard Plate-Count” yöntemi nicel ölçümlerde kullanılmaz. Bu durumun sonucunda yeni güvenilir yöntemleri ve bilgi verici sonuçları verecek şekilde metotlar dizayn edilmiştir (3). Bir biofilmin yapısını belirlemek için çeşitli indikatör türlerin kullanılabileceği belirlenmiştir. Bu türler biofilm içerisine girer ve onların eklenmesiyle, biofilmdeki diğer organizmaların izolasyonu yapılmadan filogenetik, immünolojik veya morfolojik çalışmaların takip edilebileceği bildirilmiştir (18).
Biofilm oluşumunun daha iyi anlaşılabilmesi amacıyla, mikroorganizmaların biofilm yapıyı nasıl oluşturduklarının bilinmesine ihtiyaç vardır. Bu amaçla kullanılan bazı yöntemlerde (Ör; agar kullanımında) biofilmin agar yüzeyine dağılımının gerçekleşmesi istenir (47). Kullanılan diğer yöntemlerde ise biofilmin agar yüzeyine dağılması zorunlu değildir. Bu yöntemler arasında; Fourier transform infrared spectrometry (FT-IR) (3), spektroskopi (18, 47), boyama reaksiyonu (Gram boyama) (3, 18), taramalı ortak odaklı lazer mikroskop (3, 4, 18), nükleer manyetik rezonans (NMR) (3, 18, 47) ve floresan mikroskobu da bulunmaktadır (4, 18). Nivens ve ark. (20), biofilmlerin metabolik aktivitesi ve kimyasal yapısını belirlemek için kullanılan bazı yeni yöntemler de tanımlamışlardır. Bu uygulamalara çeşitli mikroskobik, spektrokimyasal, elektrokimyasal ve piezoelektriksel analiz yöntemleri de dâhildir.
Gıda İşlemeye Bağlı Biofilm Oluşumu
Doğal ve endüstriyel su teminlerinde, suyun düşük besin maddesi içeriğine sahip olmasına karşın suyun temas ettiği yüzeylerde biofilm oluşur. Ortamda bulunan planktonik hücrelerin sayısı, biofilmdeki hücrelerin sayısından 500 ila 50.000 kat daha düşüktür. İçme sularında doğal olarak bulunan bakteriler Flavobacterium, Moraxella, Acinetobacter, Bacillus, Pseudomonas, Alcaligenes ve Achromobacter’dir (3).
Streptococcus thermophilus; süt işleme ekipmanlarında ısı değiştiricilere tutunmuş olarak bulunabilmektedir. Pastörizatörlerin giriş ve çıkış kısımlarında biofilm oluşumu görülebilir (4). Bacillus cereus sporlarına sütte rastlanır ve bu sporlar hidrofobik özellikte olduklarından işleme ekipmanlarındaki boruların yüzeylerinde birikmesinden dolayı sorunlara yol açmaktadır. Sütün pastörizasyon işlemi çoğu zaman ortamdaki sporları yok etmek için yeterli değildir ve bu uygulamayla sadece vejetatif hücreler öldürülür. Temizleme işlemi Bacillus cereus sporları üzerine etkili değildir ve bu sporlar paslanmaz çelik yüzeyler üzerine tutunmaya devam ederler. Bu durum; Bacillus sporlarının sütte bulunduğu ve süt veya süt ürünlerinin oda sıcaklığında muhafaza edilmesi durumunda spor oluşturabileceği ihtimalinin olduğunu gösterir. Bacillus sporları tarafından üretilen iki enterotoksin, farklı ısı stabilitelerine (termo-stabil ve termo-labil) sahiptir. Termo-stabil sporlar sadece sütte bulunurlar. Bununla birlikte normalde gıda zehirlenmesine sebep olan herhangi bir madde de üretmezler (42).
Listeria monocytogenes ve insanlar için patojen olan diğer mikroorganizmalar; et, süt ve diğer gıda çeşitleriyle birlikte gıda işletmelerinde bulunabilmektedir. Listeria monocytogenes’e lağım kanallarında, yoğunlaşmış veya durgun sularda, zeminler ve işleme ekipmanlarında da rastlanabilmektedir (4). Temizlik yapıldığında dahi Listeria monocytogenes havada yaşayabilir ve bir kontaminasyon tehdidi olmayı sürdürür.
Kir ve pek çok organik materyal; contalar üzerine birikebildiğinden işleme ekipmanlarındaki contalar biofilm oluşumu için ideal ortamları oluştururlar. Mikrobiyal üreme açısından contalar ile birlikte, vanalar da uygun bir ortam oluştururlar. Gıda işleme sistemlerinde kullanılan contaların pozisyonundan dolayı, aşınmaya oldukça fazla maruz kalırlar. Conta üretiminde hammadde olarak kauçuk ve teflon kullanımı test edildiğinde, kauçuğun mikroorganizmalar tarafından enerji kaynağı olarak kullanıldığı görülmüştür (3). Contalar ve vanalarla birlikte, borulu sistemlerdeki ölü noktalar da mikrobiyal gelişme için uygun ortamları oluştururlar.
Biofilmler; hammadde, ara ürün ve son ürünler için sürekli bir kontaminasyon kaynağı haline dönüşmektedir. Biofilm oluşumu ürünün raf ömrünün azalmasına, mikrobiyal kaynaklı gıda bozulmalarına ve enfeksiyonlara yol açabilir. Ayrıca bu oluşum sistemdeki sıvı akışını ve enerji transferini engelleyerek enerji kayıplarına da neden olabilmektedir. Bu durum ekonomik kayıplara yol açabildiği gibi, işlemin gerektirdiği sıcaklık ve sıvı akışı gibi çeşitli üretim parametrelerine tam ulaşılamamasına da neden olabilmektedir. Biofilmler gıda işletmelerinde her türlü yüzeyde oluşabilmesine karşılık; taban, drenaj sistemleri, konveyörler, çizik ve çatlaklar, boru yivleri, köşeler ve temizlik işlemlerinin zor uygulandığı bölgeler biofilm oluşumunun en fazla görüldüğü yerlerdir (14). Genel olarak, pürüzlü yüzeyler üzerine mikroorganizmaların bağlanması çok daha kolay gerçekleşir (48, 49, 50).
SONUÇ
Mikroorganizmaların kullanacağı besin maddeleri sınırlandırıldığında planktonik hücreler, yerleşik hücreleri oluşturur. Bu mikroorganizmalar tutunabilmek / yapışabilmek ve canlılığını devam ettirebilmek amacıyla proses ekipmanlarına tutunan organik materyale lokalize olma teşebbüsündedirler. Bu ortam oluştuğunda tutunmanın geri dönüşümlü ve geri dönüşümsüz fazı başlar ve böylece biofilm oluşumu meydana gelir. Biofilmin yapısındaki bu mikroorganizmalar antibiyotikleri içeren çeşitli kimyasallara, ısı, ışık ve kurumaya karşı direnç kazanırlar. Doğru deterjanlar ve dezenfektanların kullanımıyla biofilm oluşumunu önlemek bu açıdan önemlidir. Temizleme işlemi sıklıkla (yaklaşık 8 saatte bir) tekrarlanmalıdır. Temizlemeye ilaveten, malzeme seçimi biofilm oluşumunun eğilimi üzerine etkilidir. Biofilmler genelde borulardaki çatlaklarda, köşelerde, contalarda, bağlantı yerlerinde veya borulu sistemlerin ölü noktalarında bulunmaktadır.
Ekipman yüzeyindeki alt tabakaya yapışan mikroorganizmaların fenotipi değişir ve bu şekliyle planktonik benzerlerinden ayrılırlar. Biofilmde mikroorganizmaların sayılarının ve türlerinin belirlenmesinde “Plate-count” gibi standart yöntemlerin kullanılması hatalı sonuçlar verebilir ve bunun için kullanılmaları da önerilmez. Sonuç olarak, biofilm oluşumunun engellenmesi amacıyla temizlik ve dezenfeksiyonda hızlı, uygun ve doğru yöntemlerin seçilmesi ve uygulanması önerilir.
KAYNAKLAR
1. Zottola EA, Sasahara KC. 1994. Microbial biofilms in the food processing industry-Should they be a concern? Int J of Food Microbiol, 23, 125-148.
2. Costerton JW, Cheng KJ, Geesey GG, Ladd TI, Nickel JC, Dasgupta M, Marrie TJ. 1987. Bacterial biofilms in nature and disease. Annual Rev of Microbiol, 41, 435-464.
3. Mattila-Sandholm T, Wirtanen G. 1992. Biofilm formation in the industry: A Review. Food Rev Int, 8 (4), 573-603.
4. Genigeorgis, C. 1995. Biofilm: Their significance to cleaning in the meat sector. In: Burt, S. A. and Bauer, F. (Eds), New Challenges in Meat Hygiene: Specific problems in cleaning and disinfection, Ecceamst, European Consortium for Continuing Education in Advanced Meat Sci and Technol, pp. 29-47.
5. Chen J, Rossman ML, Pawar DM. 2007. Attachment of enterohemorragic Escherichia coli to the surface of beef and a culture medium. LWT – Food Sci and Technol, 40, 249–254.
6. Frank JF, Ehlers J, Wicker L. 2003. Removal of Listeria monocytogenes and poultry soil-containing biofilms using chemical cleaning and sanitizing agents under static conditions. Food Protect Trends, 23, 654–663.
7. Jessen B, Lammert L. 2003. Biofilm and disinfection in meat processing plants. Int Biodeterioration & Biodegradation, 51, 265–269.
8. Somers EB, Wong AC. 2004. Efficacy of two cleaning and sanitizing combinations on Listeria monocytogenes biofilms formed at low temperature on a variety of materials in the presence of ready-to-eat-meat residue. J of Food Protect, 67, 2218–2229.
9. Langsrud S, Sidhu MA, Heir E, Holck AL. 2003. Bacterial disinfectant resistance – a challenge for the food industry. Int Biodeterioration & Biodegradation, 51, 283–290
10. Simões M, Vieira MJ. 2009. Persister cells in Pseudomonas fluorescens biofilms treated with a biocide. In Proceedings of the international conference processes in biofilms: Fundamentals to Applications (pp. 58–62), Davis, CA, USA.
11. Simões M, Simões LC, Machado I, Pereira MO, Vieira MJ. 2006. Control of flow-generated biofilms using surfactants – evidence of resistance and recovery. Food and Bioproducts Process. 84, 338–345.
12. Bremer PJ, Fillery S, McQuillan AJ. 2006. Laboratory scale clean-in-place (CIP) studies on the effectiveness of different caustic and acid wash steps on the removal of dairy biofilms. Int J of Food Microbiol, 106, 254–262.
13. Gram L, Bagge-Ravn D, Ng YY, Gymoese P, Vogel BF. 2007. Influence of food soiling matrix on cleaning and disinfection efficiency on surface attached Listeria monocytogenes. Food Control, 18, 1165–1171.
14. Carpentier B, Cerf O, 2000, Biofilms. Encylopedia of Food Microbiology. Robinson, R. K., Batt, C. A., Radip, P. and Palet, D. (eds.), Volume I, Academic press. pp. 252-259.
15. Ray B, 1996, Fundamental Food Microbiology, CRC Press, pp. 457-459.
16. Andrade NJ, Bridgeman TA, Zottola EA. 1998, Bacteriocidal activity of sanitizers against Enterococcus faecium attached to stainless steel as determined by plate count and impedance methods, J. Food Protect., 61 (7), 833–838.
17. Floyd JK, Gonpot P, Smith R. Richter A. 2003. Regulation of Alginate biosynthesis and biofilm formation. http://www.erc.montana.edu (erişim tarihi:03.06.2011)
18. Costerton JW, Leweandowski Z, Caldwell DE, Korber DR, Lappin-Scott HM. 1995. Microbial biofillms. Annual Rev. of Microbiol, 49, 711-745.
19. Marshall KC, 1992. Biofilms: An overview of bacterial adhesion, activity, and control of surfaces. ASM news, 58, 202-207.
20. Nivens DE, Palmer R J. White, DC. 1995. Continuous nondestructive monitoring of microbial biofilms: A review of analytical techniques. J of Indust Microbiol, 15, 263-276.
21. Fletcher M. 1991. The physiological activity of bacteria attachment to solid surfaces. Adv. in Microbial Physiol., 32, 53-85.
22. Kumar CG, Anand SK. 1998, Significance of microbial biofilms in food industry : a review, Int J of Food Microbiol, 42, 9-27.
23. Poulsen LV, 1999, Microbial biofilm in food processing : Review, Lebensm.-Wiss. u.-Technol., 32, 321-326
24. Forsythe, S.J. 2000. The microbiology of safe food. Blackwell Science, London
25. Johansen C, Falholt P. Gram L. 1997. Enzymatic removal and disinfection of bacterial biofilms. Appl. and Environment. Microbiol., 9, 3724-3728.
26. Sutherland IW. 2001. Biofilm exopolysaccharites: A strong and sticky framework. Microbiol. 147:3-9
27. Marshall KC, Stout R, Mitchell R. 1971. Mechanisms of the initial events in the sorption of marine bacteria to surfaces. J of General Microbiol., 68, 337-348.
28. Zottola EA. 1994. Scientific status, summary, microbial attachment and biofilm formation, a new problem for the food industry. Food Technol., 48 (7), 107-117.
29. Denyer SP, Hanlon GW, Davies MC. 1993. Mechanisms of Microbial Adherence. In: Denyer, S. P., Gorman, S. P. and Sussman,M. (Eds), Microbial biofilms: Formation and control. Oxford: Blackwell Sci. Public., pp. 13-27.
30. Costerton JW. Lappin-Scott HM. 1993. Introduction to Microbial biofilms. In: Lappın-Scott, H. M. and Costerton, J. W. (Eds), Microbial Biofilms, Plant and Microbial Biotechnology Research Series 5, Cambridge: Cambridge University Press pp. 1-11.
31. Arnold JW., Silvers S, 2000, Comparison of poultry processing equipment surfaces for susceptibility to bacterial attachment and biofilm formation, Poultry Sci, 79, 1215-1221.
32. Bower CK, McGuire J, Daeschel MA, 1996, The adhesion and detachment of bacteria and spores on food-contact surfaces, Review, Trends in Food Sci & Technol, 7, 152-157.
33. Frank JF, Chmielewski RAN, 1997, Effectiveness of sanitation with quaternary ammonium compound or chlorine on stainless steel and other domestic food-preparation surfaces, J Food Protect, 60 (1), 43-47.
34. Rossoni EMM, Gaylarde CC. 2000, Comparison of sodium hypochlorite and peracetic acid as sanitising agents for stainless steel food processing surfaces using epifluorescence microscopy, Int J Food Microbiol, 61, 81–85.
35. Sinde E, Carballo J, 2000, Attachment of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes to stainless steel, rubber and polytetrafluorethylene : The influence of free energy and the effect of commercial sanitizers, Food Microbiol, 17, 439-447.
36. Joseph B, Otta SK, Karunasagar I, 2001, Biofilm formation by Salmonella spp. on food contact surfaces and their sensitivity to sanitizers, Int J of Food Microbiol, 64, 367-372.
37. Mead GC, 2000, Fresh and further-processed poultry. The Microbiological Safety and Quality of Food. Lund, B. M., Baird–Parker, T. C., Gould, G. W. (Eds.), Volume I, An Aspen Public., pp. 445-471.
38. Frank JF, Koffi RA, 1990. Surface-adherent growth of Listeria monocytogenes is associated with increased resistance to surfactant sanitizers and heat. J of Food Protect, 53, 550-554.
39. Krysinski EP, Brown LJ. Marchisello TJ. 1992. E!ect of cleaners and sanitizers on Listeria monocytogenes attached to product contact surfaces. J of Food Protect, 55, 246-251.
40. Hoyle BD, Alcantara Costerton JW. 1992. Pseudomonas aeruginosa biofilms as a diffusion barrier to piperacillin, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 36, 2054-2056.
41. Simões L, Vieira M., 2010. A review of current and emergent biofilm control strategies, LWT- Food Sci. and Technol. 43, 573-583.
42. Anderson A, Rog Nner U. Granum PE. 1995. What problems does the food industry have with the spore-forming pathogens Bacillus cereus and Clostridium perfringens? Int J of Food Microbiol, 28, 145-155.
43. Lechevallıer MW, Cawthon CD. Lee RG. 1998. Factors Promoting Survival of Bacteria in Chlorinated Water Supplies. Appl and Environment Microbiol. 54 (3), 649-654.
44. Muatapha A. Liewen MB. 1989. Destruction of Listeria monocytogenes by sodium hypochlorite and quaternary ammonium sanitizers. J of Food Protect, 52, 306-311.
45. Şener A, Temiz, A. 2004. Tavuk kesimhane ve işletmelerinde kullanılan ticari dezenfektanlar ve etkinlikleri, Orlab On-Line Mikrobiyoloji Dergisi Yıl: 2004 Cilt: 02 Sayı: 10 Sayfa: 1-28 www.mikrobiyoloji.org/pdf/702041001.pdf
46. Jass J, Costerton JW. Lappın-Scott H.M. 1995. Assessment of a chemostat coupled modified Robbins device to study biofilms. J of Industrial Microbiol, 15, 238-289.
47. Lappın-Scott HM. Jass J. Costerton JW. 1993. Microbial biofilms, Formation and characterization. In: Denyer, S. P., Gorman, S. P. and Sussman, M. (Eds), Microbial biofilms: Formation and Control, Oxford: Blackwell Sci. Public. pp. 1-12.
48. Oulahal N, Brice W, Martial A, Degraeve P. 2008. Quantitative analysis of survival Staphylococcus aureus or Listeria innocua on two types of surfaces: propylene and stainless steel in contact with three different dairy products. Food Control, 19, 178–185.
49. Patel JD, Ebert M, Ward R, Anderson JM. 2007. S. epidermidis biofilm formation: Effects of biomaterial surface chemistry and serum proteins. J of Biomedical Mat Res A, 80, 742–751.
50. Simões M, Simões LC, Cleto S, Pereir MO, Vieira MJ 2008. The effects of a biocide and a surfactant on the detachment of Pseudomonas fluorescens from glass surfaces. Int J of Food Microbiol., 121, 335–341.